自荷蘭博物學家、顯微鏡創(chuàng)制者Antonie van Leeuwenhoek(1632-1723)在17世紀次將光線通過透鏡聚焦制成光學顯微鏡并用它觀察微生物(microorganisms or animalcule)以來，顯微鏡就一直是生物學家從事研究工作、探尋生命奧秘必不可少的利器。正是因為有了Leeuwenhoek的這項偉大發(fā)明及其后繼者對顯微鏡技術的不斷改進和發(fā)展，人們才能夠對細胞內部錯綜復雜的亞細胞器等結構的形態(tài)有了初步的了解。

      此后，研究人員對顯微鏡技術的追求從未停歇過，他們總是希望能得到分辨率更高的顯微鏡，從而更好地觀察細胞內部更細微的結構。近，《自然-方法》(Nature Methods)雜志上報道的超高分辨率成像技術(super-resolution imaging, SR imaging)終于使得人們可以在單分子水平上進行觀察研究。

　　SR技術的發(fā)展過程

　　在達到今天SR技術水平的過程中，承載了許許多多研究人員辛勤勞動的汗水，也面臨著諸多亟待解決的難題。

       在以上這些光學SR成像技術中有兩種技術——受激發(fā)射減損顯微鏡(stimulated emission depletion microscopy, STED)和飽和結構光學顯微鏡(saturated structured illumination microscopy，SSIM)受關注。

　　近，基于探針SR成像技術的光敏定位顯微鏡(PALM)和隨機光學重建顯微鏡(STORM)，以及借助熒光基團隨機激活特性的熒光光敏定位顯微鏡(FPALM)都已經取得了成功。

　　通過基于探針的SR成像技術，可以獲得多張原始圖像。在每一張原始圖像中，細胞內只有一部分被熒光標記的分子能發(fā)出熒光，即這些熒光分子都處于不斷激活和滅活的交替狀態(tài)，每一次都只有部分分子能被觀察并成像。而且由于每次發(fā)出熒光的分子都分散得較為稀疏，因此相互之間不會受到影響，也就避免了因相鄰分子發(fā)出熒光而無法分辨的問題。后將這些原始圖片疊加、重合在一起就得到了終的高分辨率圖像。這樣，就能使得那些以前由于熒光點太密以至于無法成像的結構的分辨率達到納米級水平，而且成像的分子密度也相當高，可以達到105個分子/μm2。

　　這種分辨率對于生物學家來說，意味著現在可以在分子水平上觀察細胞內的結構及其動態(tài)過程了。

       雖然顯微鏡技術已經發(fā)展到了如此高度，但它仍然只是生物學家研究中使用的一種工具。因此還需要將顯微鏡獲得的圖像與其它的試驗結果互相參照，才能獲得準確的結果。人們需要認清SR顯微鏡的優(yōu)勢與劣勢，為操作以及判斷SR圖像制定出標準化的操作規(guī)范，只有這樣才能大限度地發(fā)揮SR顯微鏡的作用。

　　現在，由于人們對細胞內各組份的組織結構以及它們的動態(tài)變化過程都只有一個概念上的認識，因此，借助顯微鏡從納米水平上對這些結構及過程進行真實的觀察能讓人們發(fā)現許多以往所不了解的東西。例如，以前人們通過電鏡發(fā)現細胞骨架是由大量絲狀網格樣組織構成時，就有人對此現象持懷疑態(tài)度。那些認為細胞骨架是一種用來稀釋細胞內生化物質濃湯這樣一種結構的細胞生物學家把這種觀測結果稱作僵化的人為試驗結果。

　　除非新的SR顯微鏡圖像或者其它的試驗結果都能證明細胞骨架是由大量的絲狀網格樣組織構成的，否則還會有人持上述的懷疑觀點。不過已經有其它的生化試驗結果證實了早期的電鏡觀察結果是正確的。當然新興的SR技術也需要其它傳統(tǒng)的生化試驗結果予以佐證才有價值，同時還需要電鏡的輔助。因為電鏡能提供納米級的觀察結果，這對于佐證具有同樣分辨率的SR顯微鏡觀測結果來說是有價值的。

　　今后，大家在逐步了解、接受和廣泛使用SR顯微鏡的同時，需要注意將會出現的各種問題，以下的表格列出了部分與SR顯微鏡使用相關的缺點及其目前的解決方法。

       近幾年，就如何處理圖像已經有了非常嚴格的操作規(guī)范。不過迄今為止，對于怎么處理SR圖像還沒有一個標準的操作規(guī)范。尤其需要指出的是，PALM和STORM數據在某些重要因素上，graph方面的共性要多于image方面。在一張SR圖像上，分子的不確定性和密度都能用顏色表示出來，這種圖像把細胞內該分子有可能出現的任何地點都標示出來了。而且只有被標記的分子按照一定的標準(發(fā)出的光子數)判斷它的確是一個單分子并且定位準確之后才顯示出來。必須對獲得的圖像進行這樣的標準化處理之后才能分析結果。同樣，對于試驗數據也需要如此進行標準化處理。要提高分辨率不僅需要分子定位、分布得比較好，還需要分子數目夠多，以致能達到尼奎斯特判斷法(Nyquist criterion)的要求，即分子間的平均距離要小于顯微鏡分辨率的一半。雖然上述問題都不會影響SR顯微鏡的應用，但由于存在這些問題，所以我們應該時刻提醒自己，一定要仔細判讀、分析SR顯微鏡的圖像結果，只有這樣才能得到有價值的生物學結論。